SARS | Investigación química de Chuzhou Inc.

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 556 (2023) Citar este artículo

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Desde la aparición de las variantes de Omicron a fines de 2021, rápidamente se convirtieron en las variantes dominantes a nivel mundial. Las variantes de Omicron pueden transmitirse más fácilmente en comparación con el Wuhan anterior y las otras variantes. En este estudio, nuestro objetivo fue dilucidar los mecanismos de la infectividad alterada asociada con las variantes de Omicron. Evaluamos sistémicamente las mutaciones ubicadas en la secuencia S2 de la espiga e identificamos las mutaciones que son responsables de la fusión viral alterada. Demostramos que las mutaciones cerca del sitio de escisión S1/S2 disminuyen la escisión S1/S2, lo que da como resultado una fusogenicidad reducida. Las mutaciones en HR1 y otras secuencias S2 también afectan la fusión célula-célula. Según los estudios de resonancia magnética nuclear (RMN) y el modelado in silico, estas mutaciones afectan la fusogenicidad posiblemente en múltiples pasos de la fusión viral. Nuestros hallazgos revelan que las variantes de Omicron han acumulado mutaciones que contribuyen a una formación reducida de sincitios y, por lo tanto, a una patogenicidad atenuada.

La variante Omicron BA.1 de SARS-CoV-2 se informó por primera vez en Sudáfrica a fines de 2021 y rápidamente se convirtió en una variante dominante de preocupación (VOC) a principios de 20221. Los datos recientes mostraron que está correlacionado con casos más altos. números y respuestas más bajas al anticuerpo neutralizante1. Hay cinco COV, incluidos Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) y Omicron (originalmente B.1.1.529, reclasificado en BA linajes) así como dos variantes de interés (VOI) que incluyen Lambda (C.37) y Mu (B.1.621) según la Organización Mundial de la Salud a diciembre de 20212. Entre los VOC, la variante BA.1 y variantes relacionadas ( BA.2, BA.4, BA.5) surgieron como las variantes circulantes dominantes en 2022 y portan más de 30 mutaciones en su proteína espiga. Para BA.1, existen más de 20 mutaciones en el dominio N-terminal y el dominio de unión al receptor (RBD). Las siguientes 5 mutaciones (T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H) están ubicadas en el subdominio 1/2 o cerca del sitio de escisión S1/S2 (R685) y las últimas 6 mutaciones (N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, y L981F) se colocan alrededor del sitio de escisión S2' (R815) y la región HR1 (repetición de heptada 1)3.

Se ha informado que las proteínas de pico de las variantes B.1.1.7 y B.1.617.2 son más eficientes en la fusión célula-célula en comparación con la cepa Wuhan debido a mutaciones ubicadas cerca del sitio de escisión de furina que mejoran la escisión S1/S2. eficiencia4,5. La mayor patogenicidad de las variantes B.1.1.7 y B.1.617.2 está asociada con una formación sincitial más eficiente porque la formación sincitial inducida por virus se ha relacionado con la patogénesis y la gravedad de la enfermedad6. Por otro lado, BA.1 parece ser clínicamente más infeccioso en comparación con los otros COV y datos recientes revelaron que la variante BA.1 tiene una mayor tasa de reinfección y avance de la vacuna, probablemente debido a su resistencia a los anticuerpos neutralizantes preexistentes1, 7. Curiosamente, la variante BA.1 se asocia con una enfermedad menos grave en comparación con la variante B.1.617.28. En base a la relación entre la formación de sincitios y la patogénesis, se planteó la hipótesis de que la variante BA.1 podría tener una menor capacidad de formación de sincitios. Sin embargo, los estudios posteriores sobre la formación de sincitios han sido controvertidos9,10. Dado que las mutaciones cerca del sitio de escisión de furina de las variantes B.1.1.7 y B.1.617.2 mejoraron la eficiencia de escisión de S1/S2, planteamos la hipótesis de que la formación reducida de sincitios de la variante BA.1 puede ser el resultado de mutaciones cerca del sitio de escisión de furina resultando en una escisión S1/S2 menos eficiente.

Estudios recientes han informado sobre mutaciones que afectan a los epítopos de los anticuerpos neutralizantes y RBD de la proteína espiga en las variantes BA.111,12. Aquí examinamos las propiedades biológicas de las variantes BA.1 y nos enfocamos principalmente en la fusión mediada por picos utilizando ensayos de fusión célula-célula. Mostramos que la formación sincitial atenuada no solo se debe a mutaciones cerca del sitio de escisión de furina, sino también a mutaciones en y alrededor de la región HR1. Si bien muchas de las mutaciones afectan la escisión S1/S2, algunas mutaciones en la región HR1 parecen afectar directamente el proceso de fusión inducido por el virus. Juntas, estas mutaciones explican plausiblemente el fenotipo patogénico alterado de las variantes BA.1.

Las secuencias de proteínas de espiga alineadas de todas las variantes principales del SARS-CoV-2 muestran que muchas mutaciones están mucho más comúnmente presentes en las secuencias de espiga de BA.1 y variantes relacionadas en comparación con otras variantes, incluidas muchas que afectan el dominio S2, que media la célula. -fusión celular después de la unión del receptor por el dominio S1 (Fig. 1 complementaria). Estudios previos sugirieron que la variante BA.1 tiene una fusogenicidad menor que la cepa ancestral (Wuhan) del SARS-CoV-210,13. Para confirmar la fusogenicidad de BA.1 y linajes anteriores, incluidos Wuhan, B.1.1.7, B.1.351 y B.1.617.2, realizamos ensayos de fusión célula-célula utilizando SmBit-LgBit (luciferasa dividida) y el Sistemas GFP-RFP que fueron desarrollados previamente en nuestro laboratorio14. También intentamos expresar constitutivamente la proteína S utilizando lentivirus recombinantes y seleccionando células transfectadas de construcción que expresan S mediante un marcador de antibiótico antes, pero esas estrategias no tuvieron éxito. Sin embargo, dado que nuestro sistema de transfección transitoria previamente desarrollado aseguró una alta eficiencia de transfección, decidimos utilizar este sistema para el resto de los experimentos. En estos sistemas se probaron tanto las construcciones S truncadas C-terminal (localización de la superficie celular más eficiente) como las construcciones S de longitud completa. Brevemente, las células donantes (células HeLa) expresan la proteína de fusión S-SmBit o S-GFP y las células receptoras (293ACE2) expresan LgBit o RFP. Dado que las células HeLa no expresan ACE215, no se autofusionan. La microscopía confocal demuestra una expresión similar de proteínas de pico en las células HeLa del donante (Fig. 2a complementaria). Después de la fusión exitosa entre las células del donante y el receptor, las señales luminiscentes pueden detectarse debido a la interacción de SmBit y LgBit y las señales de fluorescencia amarilla de la colocalización de GFP y RFP. Como era de esperar, observamos que BA.1 muestra una fusogenicidad significativamente menor tanto en los sistemas SmBit-LgBit (Fig. 1a) como en los sistemas GFP-RFP (Fig. 1b, c). Las señales de colocalización de GFP-RFP fueron cuantificadas por ImageJ y se muestran en la Fig. 1b. En general, las variantes S truncadas C-terminales mostraron una mayor fusogenicidad en comparación con las variantes S no truncadas como se esperaba (Fig. 3 complementaria).

Se realizó un ensayo de fusión célula-célula con SARS-CoV-2 variantes S (ver Métodos). Las diversas células de donante transfectadas con S-SmBit truncadas (HeLa) y las células del receptor transfectadas con LgBit (293ACE2) se mezclaron 24 h después de la transfección y se incubaron durante 48 h. Después de la incubación, las señales de luminiscencia se midieron con un lector de placas POLARstar Omega. Todos los puntos de datos se presentan como valores medios (desviación estándar (DE), n = 8 réplicas biológicas independientes). b, c De manera similar, las diversas células del donante transfectadas con S-GFP (HeLa) y las células del receptor transfectadas con RFP (293ACE2) se mezclaron 24 h después de la transfección y se incubaron durante 48 h adicionales. Después de la incubación, las señales de colocalización entre GFP y RFP se midieron utilizando el microscopio de fluorescencia CellSens. El plásmido que expresa GFP-SmBit se transfectó en células donantes (HeLa) para el control. Para la cuantificación, se seleccionaron aleatoriamente 10 campos para medir la actividad de fusión (n = 10). Las señales de colocalización fueron cuantificadas por ImageJ. Para la comparación estadística, se muestran los valores de P ajustados (frente a Wuhan, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns: no significativo). Todos los resultados son representativos de tres experimentos independientes. Barra de escala 50 µm. d Las diversas células del donante transfectadas con S-SmBit truncado (HeLa) y las células del receptor transfectadas con LgBit (293ACE2) se mezclaron 24 h después de la transfección y se trataron con cinco concentraciones diferentes (30 µg/mL, 10 µg/mL, 3 µg/ mL, 1 µg/mL, 0,3 µg/mL) de anticuerpo anti-S. 48 h después de la mezcla, se midieron las señales de luminiscencia utilizando un lector de placas POLARstar Omega. Todos los puntos de datos se presentan como valores medios (SD, n = 4 réplicas biológicas independientes).

Un anticuerpo anti-S policlonal neutralizante que se dirige al dominio S2 bloqueó la fusión de todas las variantes del SARS-CoV-2 de manera similar (Fig. 1d). Los inhibidores de fusión descritos anteriormente, como el 25-hidroxicolesterol (25-HC), el itraconazol y la diclorciclizina, mostraron una inhibición dependiente de la dosis similar de la actividad de fusión de las variantes del SARS-CoV-2 (Fig. 4 complementaria)14,16. También confirmamos que las diferentes actividades fusogénicas de las variantes de SARS-CoV-2 están respaldadas por los niveles de expresión de proteína de pico total comparables entre las variantes mediante el ensayo de transferencia Western (Fig. 4a) y los patrones de distribución celular similares entre las variantes observadas por microscopía confocal (Fig. 2a complementaria). A continuación, probamos la citotoxicidad potencial debido a la expresión de la proteína pico y no observamos ninguna diferencia significativa entre las variantes (Fig. 2b complementaria). Además, medimos la infectividad de las variantes usando pseudopartículas del virus de la estomatitis vesicular (VSV) recubiertas de SARS-CoV-2 S y descubrimos que B.1.1.7, B.1.351, B.1.617.2 y BA.1 mostraron una infectividad general más alta que el Cepa ancestral de Wuhan (Fig. 5 complementaria). La infectividad de BA.1 infeccioso parecía depender de las líneas celulares probadas10,17,18. Curiosamente, aunque la fusogenicidad de BA.1 fue sustancialmente más baja que la de Wuhan, su infectividad fue comparable, si no más alta, que la de Wuhan en nuestro sistema. La mayor infectividad de BA.1 probablemente se deba a mutaciones en la región S1, como el dominio de unión al receptor, que confiere una mayor afinidad a ACE210. El efecto combinado de una mayor participación del receptor y una menor fusogenicidad aún puede dar como resultado una mayor infectividad.

Un estudio anterior mostró que las células infectadas con SARS-CoV-2 expresan la proteína espiga en su superficie celular y forman sincitios con las células vecinas positivas para ACE219. Para confirmar la formación de sincitios en células infectadas con SARS-CoV-2 y probar la fusogenicidad de varias variantes de SARS-CoV-2, realizamos un ensayo de fusión de virus vivo. Para este ensayo, se transfectó una línea celular Huh7.5 que expresaba de forma estable ACE2 y TMPRSS2 (Huh7.5-A2T2) con plásmido GFP y se seleccionó con el antibiótico G418. Luego, esta línea celular estable se infectó con varias variantes del SARS-CoV-2. A las 24 horas de la infección se detectó la formación de sincitios (Fig. 2a). La tinción empaquetada con dilactato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, núcleos) se representa como un sincitio (mancha GFP) y se amplía en cada imagen insertada. Se detectó una fusogenicidad más alta en las células infectadas con las variantes B.1.1.7 y B.1.617.2 y se mostró una fusogenicidad más baja para la variante BA.1. La variante B.1.351 no demostró una diferencia significativa en comparación con la cepa Wuhan. Para la cuantificación, se seleccionaron aleatoriamente 20 campos y la fusogenicidad se cuantificó por el número de núcleos teñidos con DAPI dividido por el número de manchas GFP (Fig. 2b). En conjunto, las variantes del SARS-CoV-2 mostraron un comportamiento fusogénico similar al de los hallazgos de los ensayos de fusión de células desencadenadas por S informados en las Fig. 1a, b.

Se sembraron células Huh7.5-A2T2 que expresan GFP en placas de 96 pocillos. 24 h después de la siembra, las células se infectaron con variantes de SARS-CoV-2 y se incubaron durante 2 h. Las células se lavaron después de 2 h y se incubaron durante otras 22 h seguido de fijación con paraformaldehído (PFA) al 4%. Después de la incubación, se usó DAPI para la tinción de núcleos. Las señales GFP y DAPI se evaluaron utilizando el microscopio de fluorescencia CellSens. b Para la cuantificación, se seleccionaron aleatoriamente 20 campos para medir la actividad de fusión (n = 20). La fusogenicidad se cuantificó por el número de núcleos DAPI dividido por el número de gotas GFP. Para contar el número de gotas GFP, una gota GFP continua se contó como una célula fusionada o no fusionada. Cuando hay una intensidad de señal de GFP discontinua o una señal de GFP en forma de gota circular discontinua en la gota, se contaron por separado para distinguir las células vecinas no fusionadas de las células fusionadas. Se siguen los números promedio de núcleos DAPI y blobs GFP por ubicación; Wuhan (DAPI: 103,7, GFP: 19,4), B.1.1.7 (DAPI: 98,3, GFP: 12,0), B.1.351 (DAPI: 86,4, GFP: 14,3), B.1.617.2 (DAPI: 122,6, GFP : 11,0), BA.1 (DAPI: 68,6, GFP: 23,0), Simulacro (DAPI: 68,2, GFP: 29,0). Para la comparación estadística, se muestran los valores de P ajustados (frente a Wuhan, *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns: no significativo). Todos los resultados son representativos de tres experimentos independientes. Barra de escala 50 µm.

Para investigar los efectos de las mutaciones en la variante BA.1, introdujimos mutaciones individuales o combinadas en las secuencias de picos de Wuhan o BA.1. Primero, introdujimos mutaciones individuales en la secuencia del pico BA.1. Entre más de 30 mutaciones en la variante BA.1 (Fig. 1 complementaria), decidimos buscar las 11 mutaciones C-terminal, que probablemente afectan la actividad de fusión debido a su proximidad a S1/S2, sitios de escisión S2' y HR1 región. Dos mutaciones de estas 11 mutaciones (D614G y P681H) ya han sido caracterizadas en estudios previos20,21,22. Por lo tanto, investigamos las otras 9 mutaciones. Estas 9 mutaciones se introdujeron en la secuencia del pico BA.1 individualmente para revertir cada mutación a la secuencia de Wuhan. Entre ellas, las mutaciones inversas en el aminoácido 547 (K547T), 655 (Y655H), 856 (K856N), 954 (H954Q) y 969 (K969N) mostraron una mayor fusogenicidad en comparación con la variante BA.1 original, lo que sugiere que estas mutaciones son responsable de la disminución de la fusogenicidad de la variante BA.1 (Fig. 3a). Curiosamente, la mutación inversa en el aminoácido 981 (F981L) exhibió una fusogenicidad más baja en comparación con la variante BA.1, lo que sugiere que esta mutación puede haber surgido para compensar otras mutaciones de disminución de la función en la variante BA.1 (Fig. 3a ). Otras tres mutaciones K679N, K764N y Y796D no mostraron diferencias apreciables en la actividad de fusión de la variante BA.1.

El ensayo de fusión célula-célula se realizó con mutantes S asociados a BA.1. Las diversas células de donante transfectadas con S-SmBit truncadas (HeLa) y las células del receptor transfectadas con LgBit (293ACE2) se mezclaron 24 h después de la transfección y se incubaron durante 48 h. Después de la incubación, las señales de luminiscencia se midieron con un lector de placas POLARstar Omega. Se introdujeron mutaciones individuales en la secuencia BA.1 S. Excepto por las mutaciones correspondientes, el resto de la secuencia es la misma que la secuencia BA.1 S nativa. De manera similar, las mutaciones combinadas también se introdujeron en la secuencia BA.1 S. Todos los puntos de datos se presentan como valores medios (SD, n = 4-8 réplicas biológicas independientes). Para la comparación estadística, se muestran los valores de P ajustados (vs BA.1, *P < 0,05; ****P < 0,0001; ns: no significativo). Todos los resultados son representativos de tres experimentos independientes. b Se introdujeron mutaciones individuales en la secuencia S de Wuhan. Excepto por las mutaciones correspondientes, el resto de la secuencia es la misma que la secuencia S nativa de Wuhan. De manera similar, las mutaciones combinadas también se introdujeron en la secuencia S de Wuhan. Todos los puntos de datos se presentan como valores medios (SD, n = 4-8 réplicas biológicas independientes). Para la comparación estadística, se muestran los valores de P ajustados (frente a Wuhan, **P < 0,01; ****P < 0,0001; ns: no significativo). Todos los resultados son representativos de tres experimentos independientes. c Las actividades fusogénicas de varias construcciones S de subvariantes BA.1 se midieron de manera similar. Todos los puntos de datos se presentan como valores medios (DE, n = 8 réplicas biológicas independientes). Para la comparación estadística, se muestran los valores de P ajustados (vs BA.1, **P < 0,01; ****P < 0,0001; ns: no significativo). Todos los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

A continuación, probamos mutaciones combinadas con un conjunto cerca del sitio de escisión S1/S2 y el otro cerca del sitio de escisión S2' y en la región HR1. K547T e Y655H se introdujeron juntos en una construcción y K856N, H954Q y K969N se combinaron por separado en otra construcción. Como se esperaba, los mutantes combinados mostraron una mayor fusogenicidad en comparación con los mutantes individuales. Cuando las 5 mutaciones se combinaron por completo, la fusogenicidad fue incluso mayor que la construcción de picos de Wuhan. Como era de esperar, la fusogenicidad se redujo cuando se introdujo el F981L compensatorio putativo en las 5 mutaciones combinadas (Fig. 3a). Curiosamente, el mutante que contenía K856N, H954Q y K969N mostró una mayor fusogenicidad que el que contenía K547T y Y655H, lo que sugiere que las mutaciones cerca del sitio de escisión S2' y en la región HR1 tienen un efecto más fuerte sobre la fusogenicidad que las mutaciones cerca de S1/S2. sitio de escisión.

Para verificar los efectos de las 6 mutaciones anteriores, introdujimos mutaciones BA.1 individuales o combinadas en la secuencia de picos de Wuhan. Dado que son mutaciones inversas de las mutaciones anteriores, esperábamos que tuvieran un patrón de fusogenicidad opuesto. De hecho, las mutaciones en los aminoácidos 547 (T547K), 655 (H655Y), 856 (N856K) y 969 (N969K) mostraron actividades fusogénicas más bajas en comparación con la cepa Wuhan, lo que respalda que estas mutaciones son responsables de la disminución del fenotipo fusogénico de BA. .1 variante. Como se esperaba, la mutación en el aminoácido 981 (L981F) exhibió una fusogenicidad más alta que la cepa de Wuhan. La mutación en el aminoácido 954 (Q954H) no mostró una fusogenicidad significativamente reducida en comparación con la cepa Wuhan (Fig. 3b). Es posible que esta mutación requiera la presencia de otras mutaciones para mostrar su efecto cuando se introduce en la cepa de Wuhan. Nuevamente, las mutaciones combinadas demostraron una fusogenicidad significativamente menor que la cepa de Wuhan en un patrón que es consistente con los análisis mutacionales previos en la variante BA.1.

Para examinar más a fondo la fusogenicidad de otras subvariantes BA.1, incluidas BA.2, BA.2.12.1 y BA.4/5, generamos las secuencias de picos de la subvariante BA.1 que se muestran en la Fig. 1 complementaria. Debido a que BA.4 y BA.5 comparte la misma secuencia de picos, la etiquetamos como BA.4/5. En el ensayo de fusión célula-célula, BA.4/5 mostró una fusogenicidad ligeramente mayor y BA.2 y BA.2.12.1 no mostraron diferencias significativas con respecto a la variante BA.1 (Fig. 3c).

En conjunto, identificamos 5 mutaciones individuales que son responsables de la disminución del fenotipo fusogénico de la variante BA.1 y una mutación compensatoria que se asocia con una mayor fusogenicidad. Además, las mutaciones en o alrededor del sitio de escisión S2' y HR1 pueden tener un efecto más fuerte sobre la fusogenicidad en comparación con las mutaciones cerca del sitio de escisión S1/S2. Por último, todas las subvariantes BA.1 excepto BA. 4/5 tienen fusogenicidad comparable.

El aumento de la escisión del sitio S1/S2 se ha asociado con una mayor infectividad, fusogenicidad y patogenicidad de las variantes del SARS-CoV-223,24. Aquí nuestro objetivo es determinar si las mutaciones BA.1 identificadas anteriormente pueden dar como resultado una escisión S1/S2 reducida que explica la fusogenicidad disminuida. Probamos la escisión S1/S2 de las variantes de SARS-CoV-2 y varios mutantes de pico asociados con BA.1. Transfectamos estos plásmidos que expresan picos en Huh7.5-A2T2 y analizamos los niveles de picos de longitud completa y S2 (Fig. 4). Los niveles de proteína de pico fueron comparables entre las variantes Wuhan, B.1.1.7, B.1.351 y B.1.617.2. El nivel de proteína del pico BA.1 apareció ligeramente más bajo que las otras variantes (Fig. 4a). B.1.1.7 y B.1.617.2 mostraron niveles más altos de S2, mientras que BA.1 mostró un nivel de S2 más bajo que Wuhan (Fig. 4a). Esta diferencia en la escisión S1/S2 es similar al patrón observado en el ensayo de fusión célula-célula en la mayoría de las variantes con la excepción de la mutación Q954H, BA.2, BA.2.12.1 y BA.4/5 que son todas las subvariantes de BA.1 mostraron niveles de S2 similares a los de BA.1 y mucho más bajos que los de Wuhan (Fig. 6a complementaria). Las pruebas de mutaciones BA.1 individuales mostraron una escisión S1 / S2 variablemente reducida, que es reproducible en otras dos líneas celulares (Fig. 4b y Fig. 6b-c complementaria).

Las células Huh7.5-A2T2 se transfectaron con vectores de expresión S de variantes de SARS-CoV-2 (a) o vectores de expresión S mutantes asociados a BA.1 (b). 24 h después de la transfección, las células se recogieron con RIPA Lysis and Extraction Buffer y Protease Inhibitor Cocktail. Las muestras lisadas se procesaron adicionalmente para medir el nivel de S/S2 con un sistema de transferencia Western automatizado (Simple Western™ Automated Western Blot System). Luego, se usó ImageJ para cuantificar la intensidad relativa de la señal. Las intensidades de señal relativas normalizadas con β-actina se trazaron por separado como relación S (Completo), S2 y S2/S (Completo). Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Dado que las tres mutaciones, Q954H, N969K y L981F, residen en la región HR1, pueden afectar el proceso de fusión viral. Por lo tanto, llevamos a cabo un estudio estructural más detallado de una de estas mutaciones HR1. Anteriormente, hemos demostrado que la región HR1 (residuos N919-Q965) adopta una conformación helicoidal unida a la membrana en presencia de miméticos de bicapa (bicelas) que probablemente representa un estado intermedio unido a lípidos del proceso de fusión de la membrana viral25. En este estado unido a lípidos, la estructura de hélice α adoptada por el HR1 anfipático muestra al menos dos conformaciones que se intercambian rápidamente entre sí: un conjunto de conformadores adopta una hélice a recta regular y el otro contiene una curva. en la posición del aminoácido Q954 (Fig. 5b). Debido a que Q954H corresponde a una de las variantes de BA.1, buscamos cualquier cambio estructural asociado con esta mutación, tanto en el estado unido a lípidos como en el estado de haz de seis hélices posterior a la fusión (6HB). Anteriormente, medimos las tasas de intercambio de hidrógeno de amida (HX) de la columna vertebral para la secuencia de tipo salvaje (WT) en el estado unido a lípidos con alta precisión. Los protones de la amida del esqueleto se intercambian con el solvente cuando no participan en enlaces de hidrógeno intramoleculares o intermoleculares estables26, es decir, esta tasa de intercambio indica la fracción de tiempo en que los enlaces H se interrumpen transitoriamente. Para la mayoría de HR1, las tasas de HX para el mutante Q954H son muy similares a las de los residuos WT HR1 correspondientes, lo que sugiere propiedades dinámicas similares del mutante y el WT (Fig. 5c). Debido a que las tasas de HX son sensibles al tipo de residuo y su vecino inmediatamente anterior27, las tasas de HX para el WT y el mutante pueden diferir en el sitio de la mutación. Para eliminar esta dependencia del tipo de residuo, las tasas de HX se convirtieron en factores de protección, lo que elimina la dependencia del tipo de residuo. Nuevamente, para la mayor parte de la cadena polipeptídica de HR1, se encontró que los factores de protección eran muy similares para el mutante WT y Q954H (Fig. 5d). Sin embargo, se observa una disminución de aproximadamente tres veces en los factores de protección para el mutante Q954H en la región N953-N955, lo que sugiere que el mutante favorece la formación de la conformación retorcida. Una disminución mucho menor, de alrededor del 15 %, en la protección HX se extiende desde el residuo A944 hasta el K964. Debido a que tanto las conformaciones helicoidales rectas como las torcidas están unidas a lípidos, la medición de HX, junto con solo diferencias muy pequeñas en los cambios químicos en relación con WT (Fig. 7 complementaria), indica que la mutación Q954H no altera significativamente la propensión de unión a lípidos de HR1. El aumento en los cambios de desplazamiento químico para la región C-terminal (L959-V969) parece estar relacionado con el cambio en la población hacia el confórmero torcido para la variante Q954H.

a La secuencia de aminoácidos primaria de HR1 (residuos N919-Q965) y HR2 (residuos G1171-E1207) en negrita. En la construcción Core, una secuencia enlazadora corta y flexible (SGLVPRGSG) conecta las repeticiones helicoidales HR1 y HR2. El sitio de la mutación, Glu-954, se muestra en rojo. b Representaciones en cinta para las dos conformaciones unidas a lípidos (recta y torcida) de HR1 que están en equilibrio y se intercambian rápidamente entre sí. La mutación Q954H aumenta la población de la conformación torcida. c Índices de HX específicos de residuos y (d) los factores de protección correspondientes de HR1WT (azul) y HR1Q954H (rojo), normalizados a pH 7. Un factor de protección de 1 (línea discontinua) corresponde a ninguna protección contra el intercambio de hidrógeno, es decir, no población significativa de enlaces de hidrógeno intramoleculares. Los datos se obtuvieron en [15N/2H]-HR1Q954H 100 µM en presencia de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC)/dihexanoil fosfatidilcolina (DHPC) 100 mM (q ~ 0,5). Los datos de HR1WT se reproducen de un trabajo anterior25. e Superposición de espectros de CD Far-UV de 10 µM Core en ausencia (CoreWT-black y CoreQ954H-olive) en presencia de 4 M Urea (CoreWT-blue y CoreQ954H-red). f Fusión térmica de CoreWT (azul) y CoreQ954H (rojo) observada por CD en presencia de urea 4 M. Las temperaturas de fusión de CoreWT y CoreQ954H son de 88 °C y 90 °C, respectivamente.

De acuerdo con un estudio crio-EM informado previamente28, descubrimos que en solución, la estructura del estado de posfusión de 6HB, formado por la construcción Core (HR1 y HR2 conectados por un conector flexible corto) no se ve afectada significativamente por la mutación Q954H29 . Los espectros de CD de UV lejano de WT y Q954H del estado 6HB muestran la misma firma característica de hélice α con dos mínimos a 208 nm y 222 nm (Fig. 5e). Para descartar cualquier diferencia en la estabilidad termodinámica entre el mutante WT y Q954H, se controlaron las curvas de fusión térmica a 222 nm. Como las temperaturas de fusión reales estaban muy por encima de los 100 °C, se realizaron experimentos en presencia de un desnaturalizante para obtener una comparación cuantitativa de las dos construcciones. Curiosamente, incluso en presencia de concentraciones bastante altas de desnaturalizante, urea 4 M, la estructura secundaria del 6HB parece en gran medida imperturbable tanto para el WT como para el mutante (Fig. 5e). Se midieron temperaturas de fusión de 88 y 90 °C para WT y Q954H, lo que sugiere que no hay diferencias significativas en la estabilidad de los estados 6HB posteriores a la fusión entre las dos construcciones (Fig. 5f).

Un artículo reciente informó el requisito de pH ácido para que el SARS-CoV-2 infecte con éxito las células30. Por lo tanto, investigamos si H954, que puede cambiar su estado de protonación durante la acidificación, participa en interacciones estabilizadoras de 6HB dependientes del pH que involucran su fracción de imidazol (Fig. 8 complementaria). Tal interacción daría como resultado una desviación de su valor de pKa de 6,5, que se aplica en ausencia de interacciones de estabilización de la estructura31. El valor determinado experimentalmente para H954, pKa = 6,4, indica la ausencia de tal interacción para el estado 6HB en el rango de pH relevante para la fusión de membranas.

Las estructuras de la proteína espiga del SARS-CoV-2 en los estados de prefusión y posfusión han sido resueltas por cryo-EM32. Además, la estructura 6HB de HR1 y HR2 en el estado de posfusión se ha caracterizado aún más para las variantes28. Sobre la base de estas estructuras, modelamos las 6 mutaciones descritas anteriormente y evaluamos sus efectos potenciales sobre la estructura y función de la proteína espiga en el contexto de la fusión viral (Fig. 6). Las ubicaciones de estas mutaciones se muestran en la estructura monomérica de S (Fig. 6a). La mutación T547K se ubica en el subdominio 1/2 y forma un puente salino con D389 (Fig. 6b). Este efecto puede alterar la interacción S1/S2 y afectar la escisión S1/S2, como las mutaciones D614G y P681H20,22,24. La mutación H655Y cerca del sitio de escisión S1/S2 puede formar interacciones múltiples con otros aminoácidos adyacentes (Fig. 6c), lo que probablemente confiere una escisión S1/S2 alterada. También es posible que esta mutación pueda afectar la subsiguiente escisión de S2' después de la participación del receptor. La mutación N856K en el dominio S2 puede formar un puente salino con D568 de S1, lo que posiblemente afecte la interacción S1/S2 y reduzca la división S1/S2 (Fig. 6d). La mutación Q954H se localiza en el HR1. La glutamina de tipo salvaje, pero no la mutación de histidina, puede formar un enlace de hidrógeno con R1014 (Fig. 6e), lo que puede causar un cambio conformacional sutil del dominio S2 y dar como resultado una escisión S1/S2 menos eficiente. La mutación N969K en HR1 apunta a solvente y no produce ninguna interacción con otros aminoácidos en la estructura del trímero de prefusión. Sin embargo, esta mutación aún puede disminuir la escisión S1/S2 (Fig. 4). Es posible que esta mutación pueda tener un efecto sutil en la conformación de S2 con una menor eficiencia de escisión de S1/S2 resultante. La mutación L981F en la región distal de HR1 no tiene un efecto perceptible sobre la interacción intermolecular. Por lo tanto, no tenemos una buena explicación de su efecto sobre la escisión S1/S2.

una representación de cinta de la proteína monomérica de espiga BA.1 en la conformación cerrada. El dominio S1 se muestra en azul y el dominio S2 se muestra en gris. Las mutaciones se representan en bolas y se colorean en rojo, azul y marrón para los átomos de O, N y C, respectivamente. b Mutación de T547K en WT y BA.1. Las proteínas trímeras se muestran en cintas en gris (S2) y cian (S1). El enlace H formado entre K547 y D389 en BA.1 se muestra en la línea de puntos rojos. c Mutación de H655Y en el sitio de escisión S1/S2 (G614). Se muestra la interacción de apilamiento aromático entre H655Y y F643, mientras que se forma un enlace H adicional entre Y655 y T696 en BA.1. d Mutación de N856K observada en la variante Wuhan y BA.1. K856 forma un puente salino con D568. e Mutación de Q954H en Wuhan y BA.1. Q954 pero no H954 forma un enlace H con R1014. f Las mutaciones de Q954H, N969K y L981F en el dominio HR1 (gris) y forman interacciones de enlaces H con residuos del dominio HR2 (cian) en la estructura 6HB posterior a la fusión.

Finalmente, las mutaciones Q954H, N969K y L981F residen en el dominio HR1 que junto con el HR2 forma el 6HB en la estructura posfusión. Es posible que puedan afectar la estabilidad de 6HB y, por lo tanto, la fusogenicidad. Un estudio reciente evaluó la estructura del paquete de postfusión de picos entre las variantes de SARS-CoV-2 y mostró una estructura 6HB ligeramente desplazada de la proteína que contenía las tres mutaciones en comparación con la de la proteína de tipo salvaje28. No se prevé que la mutación Q954H perturbe la estructura 6HB ya que ambos aminoácidos pueden formar enlaces de hidrógeno con S1175 de HR2 de otro S2 (Fig. 6f). Nuestros datos de RMN anteriores tampoco mostraron ningún efecto notable de Q954H en la estabilidad de 6HB. Aunque puede parecer posible que bajo la condición de pH ácido del endosoma, el H954 pueda protonarse y afectar la estructura de 6HB, los datos de RMN de nuestra solución no mostraron ninguna perturbación de su pKa. La mutación N969K probablemente perturbaría la estructura 6HB debido a las cadenas laterales sustancialmente diferentes de asparagina y lisina. En la estructura 6HB, la cadena lateral de la asparagina (tipo salvaje) puede formar un par de enlaces de hidrógeno con el oxígeno y el nitrógeno de la columna vertebral de G1167, que pueden formar un solo enlace de hidrógeno con la cadena lateral protonada de lisina (mutante) (Fig. 6f ). Dado que las mutaciones L981F y N969K tienen efectos opuestos sobre la actividad de fusión, el efecto de L981F sobre la estructura 6HB probablemente contrarresta el de N969K, dando como resultado solo un ligero desplazamiento con ambas mutaciones en la estructura resuelta28. En la estructura actualmente disponible del 6HB, la densidad de la cadena lateral L981F no está bien resuelta y, por lo tanto, es difícil decir con certeza cualquier impacto de la mutación28. Sin embargo, sugerimos que el S1161 de HR2 puede formar un enlace de hidrógeno con el oxígeno de la columna vertebral de L981 pero no con F981 (Fig. 6f).

Desde finales de 2021, el Omicron (BA.1) y sus subvariantes surgieron y se extendieron por todo el mundo y se convirtieron en las variantes dominantes33,34,35. Debido a su rápida propagación, se pensaba que las variantes BA.1 eran más infecciosas y transmisibles. Sin embargo, los estudios in vitro, aunque siguen siendo controvertidos, no han mostrado un aumento claro de la infectividad, como los linajes anteriores. De hecho, BA.1 parece ser menos infeccioso en muchos estudios13,36. La mayor transmisibilidad de BA.1 puede ser el resultado de una mayor afinidad de la proteína espiga por el receptor ACE2 y/o una menor susceptibilidad a los anticuerpos preexistentes en la población37,38,39,40. De hecho, muchas mutaciones (>30) están presentes en la proteína espiga y se distribuyen ampliamente en la proteína S1, incluidos los dominios de unión al receptor y N-terminal y la proteína S211,12,41. Por otro lado, BA.1 parece exhibir una patogenicidad atenuada en comparación con los linajes anteriores37,38,39,40. Aquí mostramos que BA.1 tiene una fusogenicidad significativamente menor que todos los linajes anteriores, incluidas las variantes B.1.1.7, B.1.351, B.1.617.2. Razonamos que la fusogenicidad reducida probablemente contribuya a la menor patogenicidad de BA.1. Estudios anteriores han respaldado que la propiedad fusogénica del SARS-CoV-2 es uno de los factores que contribuyen a la patogénesis del SARS-CoV-242,43. Un informe reciente sugiere que la fusión mediada por picos activa la vía Caspasa-9, lo que da como resultado la activación de la piroptosis mediada por Caspasa-3/7 y gasdermina E43.

En este estudio, examinamos las mutaciones asociadas a BA.1 en la proteína espiga que pueden ser responsables de su fenotipo fusogénico atenuado. Razonamos que las mutaciones en la proteína S1 probablemente estén asociadas con una mayor unión a ACE2 y escape de anticuerpos. Sin embargo, es posible que las mutaciones en la proteína S1 puedan afectar la fusogenicidad. De hecho, se informó que algunas de las mutaciones en la proteína S1 están involucradas no solo en el aumento de la unión a ACE2 y el escape de anticuerpos, sino también en la fusogenicidad22,44,45,46. Aunque algunas de las mutaciones en la proteína S1 pueden estar involucradas en la fusogenicidad, decidimos centrarnos en 9 mutaciones que se encuentran en el subdominio 1/2, alrededor del sitio de escisión S1/S2, o en la secuencia S2 que incluye HR1, porque estos las mutaciones se observaron comúnmente en muchas de las subvariantes BA.1. Razonamos que al estudiar estas mutaciones, podemos obtener una visión mecánica de la fusogenicidad y patogenicidad de BA.1 y sus subvariantes. D614G y P681H no se estudiaron porque estas dos mutaciones ya se han caracterizado bien. La mutación D614G aumenta la infectividad, mientras que la fusogenicidad es comparable al nivel de la cepa parental de Wuhan47,48. Se informa que la mutación P681H contribuye a aumentar la actividad de fusión22.

De las nueve mutaciones, encontramos que cinco (T547K, H655Y, N856K, Q954H y N969K) contribuyen a la fusogenicidad atenuada de BA.1. Curiosamente, una mutación (L981F) mostró un efecto fusogénico opuesto, que reduce la fusogenicidad general de las cinco mutaciones combinadas. Esta mutación podría haber surgido para compensar la fusogenicidad muy reducida de otras mutaciones, por lo que el virus seguiría siendo infeccioso. Observamos que las cinco mutaciones responsables de la fusogenicidad atenuada mostraron una eficiencia de escisión S1/S2 más baja que puede explicarse mediante el modelado estructural. Un artículo reciente mostró que la mutación H655Y confiere una mayor actividad fusogénica y una mayor escisión S1/S29, que son diferentes de nuestros hallazgos. En ese estudio, los autores probaron solo una línea celular. En nuestro estudio aquí, probamos en múltiples líneas celulares con experimentos repetidos. Por lo tanto, no estamos seguros de la diferencia.

Como se describió anteriormente, las mutaciones N856K, Q954H, N969K pueden afectar la estructura de la proteína S en el estado de prefusión, lo que da como resultado una escisión reducida de S1/S2. Según los análisis de RMN y CD, la mutación Q954H también puede ejercer otro efecto, es decir, cambiar la distribución de equilibrio del conjunto estructural intermedio unido a lípidos de HR125, lo que puede afectar negativamente a la fusión viral. El efecto general de Q954H, N969K y L981F en la fusión viral puede ser más complicado. Además de su efecto sobre la escisión de S1/S2, pueden afectar el proceso de fusión en el paso necesario para formar la estructura de posfusión de 6HB. Nuestros hallazgos sugieren colectivamente que los efectos de estas mutaciones son complicados y están entrelazados. Algunas de las mutaciones pueden tener un efecto epistático en el contexto de otras mutaciones.

Las actividades fusogénicas de las variantes B.1.1.7, B.1.351 y B.1.617.2 son proporcionales a sus altas infectividades. BA.1 se comporta de manera diferente en comparación con los linajes anteriores con muchas mutaciones que surgen en los dominios S1 y S2. Es probable que las mutaciones en el dominio S1 contribuyan a la mayor afinidad entre la espiga y ACE2, lo que compensaría la fusogenicidad atenuada impartida por las mutaciones en el dominio S2. La infectividad de otras subvariantes de BA.1 parece ser más baja que la de Omicron BA.1 según nuestro sistema de virus pseudotipado (Fig. 5 complementaria). La comparación de las secuencias de estas variantes de BA.1 (Fig. 1 complementaria) indica que BA.1 tiene un patrón de mutación único en el dominio S1 en comparación con las otras subvariantes, lo que puede explicar la mayor infectividad de BA.1.

Las variantes emergentes del SARS-CoV-2 parecían ser menos susceptibles a los anticuerpos monoclonales neutralizantes aprobados que se dirigen al RBD del dominio S1, en parte debido a las mutaciones de escape en esta región49. Los esfuerzos recientes en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos contra el SARS-CoV-2 se han centrado en la estructura de hélice de tallo/péptido de fusión más conservada del dominio S2, que media la fusión viral50,51. Es tentador especular que las variantes de Omicron con numerosas mutaciones que afectan el proceso de fusión pueden haber surgido en respuesta a anticuerpos naturales contra S2 en poblaciones infectadas y posiblemente ser menos sensibles a esta clase alternativa de anticuerpos neutralizantes.

Nuestro estudio revela una interacción intrigante pero compleja de varias mutaciones en la proteína espiga de las variantes BA.1, que se han convertido en las variantes virales dominantes en todo el mundo. Estas variantes probablemente surgieron en el contexto de una inmunidad creciente y emergente contra el virus, inducida ya sea por la vacunación basada en la población o por una infección generalizada, entre la población mundial después de dos años y medio de la pandemia. Como era de esperar, la presión evolutiva seleccionó variantes que son menos susceptibles a la inmunidad existente, pero curiosamente también variantes, como los Omicrons, que son menos virulentas. Se sabe que el virus de la influenza muta el sitio de escisión de furina de su hemaglutinina para alterar el tropismo viral y la patogenicidad52. Es interesante especular que las variantes menos virulentas del SARS-CoV-2 pueden ser más transmisibles a nivel de la población porque las personas infectadas son menos sintomáticas y conscientes de su infección y, por lo tanto, se transmiten más fácilmente a otros, especialmente ante una infección menos estricta. -Precauciones de control durante el último año. El SARS-CoV-2 puede seguir evolucionando y convertirse en un virus aún menos virulento, como el virus del resfriado común, que mutará, se adaptará y se propagará en la población. Es interesante especular que un virus altamente patógeno, una vez introducido en una población huésped susceptible, puede evolucionar junto con el huésped para establecer un punto de apoyo más permanente en el universo microbiano del huésped.

Se cultivaron células HeLa, Vero E6 y CaCo-2 (HeLa, CCL-2; Vero E6, CRL-1586; CaCo-2, HTB-37; ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) en EMEM (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). , EE. UU.) y células HEK293T (CRL-3216, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) se mantuvieron en DMEM (Corning, Corning, NY, EE. UU.). Se cultivaron células 293ACE2 (células que expresan ACE2)53 y Huh7.5-A2T2 (células que expresan ACE2 y TMPRSS2, proporcionadas por Charles Rice)54 en DMEM (Corning) con 1 µg/mL de puromicina para 293ACE2 y 250 µg/mL de G418 para Huh7.5-A2T2. Las células Vero E6-T2 (células que expresan TMPRSS2, proporcionadas por las instalaciones centrales de SARS-CoV-2 en el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud) se mantuvieron en EMEM (ATCC) con 200 µg/ml de higromicina B Todos los medios se complementaron con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (MilliporeSigma, Burlington, MA, EE. UU.), excepto CaCo-2 (suero bovino fetal inactivado por calor al 20 %) y las células se mantuvieron en un ambiente de 37 °C y 5 % CO2 incubadora.

Los compuestos químicos se adquirieron de fuentes comerciales: 25-HC (MilliporeSigma), itraconazol (MilliporeSigma). Los anticuerpos contra la proteína SARS-CoV-2 S se adquirieron de varias fuentes comerciales (anti-S1, Cat#: GTX135356, GeneTex, Irvine, CA, EE. UU. y anti-S2, Cat#: PA5-116917, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU., Cat#: GTX632604, GeneTex) y se utiliza para varios ensayos virológicos. Los anticuerpos anti-β-actina (Cat#: ab8227, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-VSV (Cat#: REA005, Imanis Life Sciences, Rochester, MN, EE. UU.) también se obtuvieron comercialmente.

El plásmido de ADNc de SARS-CoV-2 S (Genscript, Piscataway NJ, EE. UU.) se adquirió de una fuente comercial. El terminal C de la secuencia S del SARS-CoV-2 (que contiene una señal de retención de ER) se truncó en 20 aminoácidos para aumentar el rendimiento del virus15,55. Con el fin de introducir un codón de parada para el truncamiento, se realizó una mutación de un solo nucleótido en el nucleótido 3759 (C a A) utilizando el kit de clonación In-Fusion (Takara, Shiga, Japón) según las instrucciones del fabricante. La secuencia S truncada se usó para reemplazar la secuencia VSV-G en el plásmido pCMV-VSV-G (número de plásmido Addgene: 8454)56 después de la digestión con BamHI. Las mutaciones en la secuencia S de las variantes B.1.1.74, B.1.35157, B.1.617.258 y todos los mutantes S individuales se introdujeron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England BioLabs, Ipswich, MA, EE. UU.), excepto para BA.111,12,41 que fue sintetizado por una fuente comercial (Genscript). Los plásmidos ensamblados se usaron para la generación de virus pseudotipados de VSV. Se generaron construcciones S de longitud completa (sin truncar) de manera similar. Los sitios de mutación para B.1.1.7, B.1.351, B.1.617.2, BA.1 y sus subvariantes (BA.2, BA.2.12.1, BA4, BA.5 y BQ.1)35 ,41 se muestran en la figura complementaria 1.

Para los ensayos de fusión célula-célula, se agregaron secuencias adicionales a las construcciones SARS-CoV-2 S anteriores para generar S-SmBit truncado y S-GFP truncado. El esqueleto de pCMV-VSV-G digerido con BamHI también se usó para ambas construcciones. Para la construcción de S-SmBit truncado, la secuencia S truncada y la secuencia de P2A-SmBit se amplificaron mediante PCR y se combinaron con el esqueleto digerido usando el kit de clonación In-Fusion de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la generación de la construcción de S-GFP truncada, la secuencia de S y P2A truncada de la construcción anterior y la GFP se amplificaron mediante PCR y se combinaron como se indicó anteriormente. Las construcciones que expresan RFP y LgBit se produjeron de manera similar utilizando el kit de clonación In-Fusion como las construcciones anteriores.

Para medir la fusión célula-célula mediada por la proteína S del SARS-CoV-2, se transfectaron células HeLa (donantes) con S fusionado con plásmido que expresa GFP o S truncado fusionado con plásmido que expresa SmBit14. SmBit es del sistema NanoBit (Promega, Madison, WI, EE. UU.) y se empareja con LgBit para emitir una señal de luminiscencia. Se transfectaron células 293ACE2 (receptoras) con RFP o plásmido que expresa LgBit. Se utilizó el reactivo de transfección FuGENE® 6 (Promega) para la transfección según las instrucciones del fabricante. La colocalización entre GFP y RFP permite la visualización de los eventos de fusión y la interacción entre las proteínas SmBit y LgBit en las células fusionadas proporciona una enzima funcional que emite señales luminiscentes. Este sistema SmBit-LgBit es adecuado para la cuantificación de eventos de fusión14. Como control negativo, se utilizó una construcción GFP-SmBit en lugar de S-SmBit. Brevemente, las células del donante y las células del receptor se transfectaron con los plásmidos apropiados mencionados anteriormente. 24 h después de la transfección, las células del donante y del receptor se separaron con EDTA 5 mM y Accutase, respectivamente. Para cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se sembraron 30.000 células donantes y 15.000 células receptoras. Se usaron placas negras de fondo transparente (Corning) para medir la fluorescencia y placas blancas (Greiner Bio-One, Kremsmunster, Austria) para medir la luminiscencia. Luego, ambas células se cocultivaron con compuestos inhibidores en DMEM que contenía FBS al 10 % durante 48 h. Para el análisis de colocalización de GFP-RFP, se eligieron aleatoriamente de 15 a 20 campos de 4 réplicas para medir las células fusionadas bajo un microscopio de fluorescencia CellSens (Olympus, Tokio, Japón). Para cuantificar las señales de colocalización, se utilizó ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.). Para la evaluación de SmBit-LgBit, se agregaron sustratos de nanoluciferasa (Furimazina) y las señales de luminiscencia se midieron con un lector de placas POLARstar Omega (BMG LABTECH, Ortenberg, Alemania) inmediatamente después de la adición de los sustratos. La señal de fondo del control GFP-SmBit se restó de todas las muestras experimentales.

Las existencias virales se generaron, mantuvieron y manipularon en base a los SOP formulados por los Institutos Nacionales de Salud en un laboratorio de nivel de bioseguridad designado apropiado. Las variantes de SARS-CoV-2 utilizadas en este estudio fueron proporcionadas por la instalación central de SARS-CoV-2 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud y recursos BEI (beiresources.org). Las referencias de las variantes son las siguientes: SVG-001/USA-WA1 (Wuhan); SVG-015 Reino Unido/CA B.1.1.7; SVG-019 RSA 1.351 501Y; SVG-028 B.1.617.2; SVG −053 BA.1 SARS‐CoV‐ 2/humano/EE. UU./HI‐CDC‐4359259‐001/2021. Todas las variantes anteriores se generaron en Vero E6-T2, que expresa TMPRSS2.

Para los ensayos de fusión de virus vivos, Huh7.5-A2T2 que expresa GFP, que se transdujo mediante un vector lentiviral, se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 40.000 células por pocillo. Después de 24 h, las células se infectaron con diferentes variantes de SARS-CoV-2 y se incubaron a 37 °C durante 2 h. 2 h después de la infección, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). 24 h después de la infección, las células se fijaron en PFA al 4% (ChemCruz, Dallas, TX, EE. UU.) para experimentos posteriores.

Un VSV recombinante pseudotipado con su propia glicoproteína VSV-G en trans fue proporcionado por Adolfo García-Sastre (Mount Sinai School of Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.)59. La secuencia de la proteína G nativa se reemplazó por la luciferasa Firefly, dando como resultado el virus recombinante defectuoso en la replicación. Para producir pseudovirus, la glicoproteína G nativa eliminada se complementó con un plásmido que expresa VSV-G.

Para generar varios virus pseudotipados, se sembraron células HEK293T a una densidad de 4 millones de células por placa de 10 cm y se transfectaron con 10 µg de plásmidos que expresan variantes S del SARS-CoV-2. Se utilizó el reactivo de transfección FuGENE® 6 (Promega) para la transfección según las instrucciones del fabricante. 24 h después de la transfección, las células se infectaron con los virus pseudotipados VSV-G y el medio se lavó y se cambió a medio fresco 4 h después de la infección. Los virus pseudotipados S de las variantes SARS-CoV-2 se recolectaron a las 24 h después de la infección. El medio que contenía el virus se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 µm y se almacenó a -80 °C.

Para el ensayo de infectividad del virus pseudotipado, se sembraron células diana en placas blancas de 96 pocillos a una densidad de 15.000 células por pocillo. Antes de la infección, se midieron los niveles de ARNm de VSV L para calcular el número de copias del genoma por volumen de stock de VSV seudotipado. Luego, las células se inocularon con el mismo número de copias del genoma. 24 h después de la siembra, las células se infectaron con la misma cantidad de virus pseudotipados. 24 h después de la infección, las células se lisaron en tampón de lisis informador Promega (Promega) durante 30 minutos, seguido de ciclos de congelación y descongelación a -80 °C. Se usó el kit de ensayo del gen informador de luciferasa Amplite™ (AAT Bioquest, Sunnyvale, CA, EE. UU.) para medir la actividad de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las señales de luminiscencia se midieron con un lector de placas POLARstar Omega (BMG LABTECH).

Para la extracción de proteínas, se mezclaron RIPA Lysis and Extraction Buffer (Thermo Fisher Scientific) y Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Basilea, Suiza) y se usaron para la lisis de muestras celulares durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras lisadas se centrifugaron durante 10 min a 12.000 rpm a 4 °C y se aislaron los sobrenadantes. Los sobrenadantes se usaron para la cuantificación de proteínas mediante el kit de ensayo de proteínas Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific). Para cuantificar la proteína diana, se realizó una transferencia Western automatizada en un sistema de transferencia Western automatizada Simple Western™ (Bio-Techne, Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los datos de imagen sin recortar se muestran en la Fig. 9 complementaria.

Los insertos de genes para la variante Q954H de SARS-CoV-2 Core (HR1 + HR2) y HR1 (Fig. 5a) se sintetizaron y clonaron en el vector pJ414 (ATUM) como se describió anteriormente25. WT y mutantes se cultivaron en Escherichia coli BL21 (DE3) a 37 °C y se indujo la expresión a una densidad óptica (600 nm) de 0,8 con una concentración final de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 2 mM durante 4 horas. HR1 WT y su variante Q954H se purificaron mediante afinidad con ácido ni-nitriloacético (Ni-NTA) y técnicas de cromatografía líquida de alta presión de fase inversa, que también incluyen la eliminación de la etiqueta His6 N-terminal por la proteasa TEV, como se describió anteriormente25. Core WT y su variante Q954H se purificaron en condiciones desnaturalizantes mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA y se plegaron en una columna de cromatografía de exclusión por tamaños (Superdex-200) en un tampón no desnaturalizante (tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 6), tampón de fosfato de sodio 150 mM (pH 6), cloruro de sodio e imidazol 5 mM)25. Las construcciones centrales retuvieron una etiqueta His6 en el extremo N-terminal.

Los espectros de CD de ultravioleta lejano se adquirieron en un espectropolarímetro JASCO J-810 usando una cubeta de 0,1 cm de paso óptico en tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 6), que contenía cloruro de sodio 30 mM. Para las muestras de Core, que no se desnaturalizaron a temperaturas inferiores a 100 °C, se probó la estabilidad después de agregar 4 M de urea. Las mediciones se realizaron en muestras de proteína 10 μM. Las curvas de fusión de CD se monitorearon a 222 nm en el rango de temperatura de 25 a 95 °C adquirido con una velocidad de rampa de 1 °C por minuto.

Se obtuvieron tasas de HX para dos muestras que contenían [15N/2H]-HR1WT o [15N/2H]-HR1Q954H 0,1 mM en tampón de fosfato de sodio 20 mM (a pH 6,5 y pH 7) que contenía cloruro de sodio 30 mM e imidazol 1 mM más 33 mM DMPC y 67 mM DHPC, una mezcla de lípidos que forma micelas mixtas en forma de disco comúnmente denominadas bicelas60,61. Las tasas de HX se midieron usando el experimento WEX-III TROSY62 usando un retraso de reciclaje (d1) de 5 s y siete duraciones del intervalo de inversión de agua, que van de 5 a 1000 ms. Las medidas se llevaron a cabo a 30 °C en un espectrómetro de 800 MHz. Las velocidades HX de la bobina aleatoria intrínseca se obtuvieron del servidor web SPHERE27. Los valores de pH de las muestras se derivaron de los cambios químicos de imidazol 1H63.

El pKa de H954 se determinó a partir de una serie de espectros 1H-15N TROSY-HSQC para una muestra que contenía [15N/2H]-CoreQ954H 0,15 mM en tampón de fosfato de sodio 20 mM y NaCl 30 mM, mediante cambios escalonados del pH de la muestra durante el rango de 5.0 a 7.6. El pKa se extrajo de los desplazamientos químicos de 1H y 15N utilizando la ecuación63:

donde δobs es el desplazamiento químico de RMN observado del pico de interés, δHA y δA son los desplazamientos químicos de la forma protonada y desprotonada.

Las células HeLa se transfectaron con plásmidos S de variantes de SARS-CoV-2 y se fijaron con paraformaldehído al 4 % (ChemCruz) 48 h después de la transfección. Después de la fijación, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % en PBS y se bloquearon con albúmina sérica bovina al 3 % (BSA, MilliporeSigma) en PBS. Anti-S2 (Cat#: GTX632604, GeneTex) se diluyeron en Triton X-100 al 0,1 % y BSA al 1 % que contenía PBS. Se añadió IgG anti-ratón de burro Alexa Fluor 555 (Thermo Fisher Scientific) a las células como anticuerpo secundario. Se usó DAPI (Thermo Fisher Scientific) para la tinción de núcleos. Las imágenes fueron tomadas por un microscopio confocal Zeiss LSM 700 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania).

El PhosphoWorks™ Luminometric ATP Assay Kit (AAT Bioquest) se utilizó para medir la viabilidad de las células diana que se transfectaron con varios plásmidos S de variantes del SARS-CoV-2. Las células HeLa se transfectaron con plásmidos S de variantes de SARS-CoV-2 y se transfirieron a placas blancas de 96 pocillos a una densidad de 10 000 células por pocillo 24 h después de la transfección. Después de 24 h adicionales, se evaluaron las actividades de luciferasa en un lector de placas POLARstar Omega (BMG LABTECH).

Las estructuras de la proteína espiga del SARS-CoV-2 de Wuhan y BA.1 se resolvieron mediante crio-EM y se recuperaron del Protein Data Bank con el PDB ID 7DZW (Wuhan), 7WK2 (BA.1, S-close) y 7WVN (BA.1, S-abierto). Antes del análisis de modelado, las estructuras de proteína de trímero variante y Wuhan se refinaron y superpusieron utilizando el programa MOE. Además, también se ha caracterizado la estructura 6HB de HR1 y HR2 en estado de posfusión28. Tanto el Wuhan (7RZV) como el BA.1 (7TIK) se obtuvieron del PDB y se utilizaron para estudios estructurales. Para definir varias interacciones intermoleculares, como enlace de hidrógeno, puente salino, etc., se utilizó el software Discovery Studio Visualizer.

Los datos se analizaron con el software GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) y se mostraron como la media (SD) de más de tres repeticiones experimentales. Los valores de P bilaterales, ajustados para la comparación múltiple de ANOVA unidireccional cuando fue apropiado, se usaron en los análisis y los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. El tamaño de la muestra utilizado para derivar cada resultado estadístico se mostró en las leyendas de las figuras correspondientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen numéricos para los gráficos se pueden encontrar en Datos complementarios. Los datos que respaldan este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

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Descargar referencias

Nos gustaría agradecer a Charles Rice (The Rockefeller University, New York, NY, EUA) por compartir las células Huh7.5-A2T2 y a Adolfo Garcia-Sastre (Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, EUA) por compartir un recombinante VSV pseudotipado con la glicoproteína VSV-G nativa. Además, nos gustaría agradecer a la instalación central de SARS-CoV-2 en el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, EE. UU. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, el Programa Anti-COVID-19 Intramural Targeted de NIH y los Programas Intramural/Extramural del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (Institutos Nacionales de Salud , EE.UU).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Rama de enfermedades hepáticas, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.

Seung Bum Park, Mohsin Khan, Parker Irvin, Madeleine Leek, Ailis Grieshaber, Zongyi Hu, Eun Sun Jang y T. Jake Liang

Laboratorio de Física Química, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.

Sai Chaitanya Chiliveri y Ad Bax

Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS), Institutos Nacionales de Salud, Rockville, MD, 20850, EE. UU.

Xin Hu

Departamento de Medicina Interna, Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Seongnam, 13620, República de Corea

Eun Sun Jang

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Conceptualización, SBP y TJL; Investigación, SBP, MK, SCC, XH, PI, ML, AG, ZH, ESJ, AB; Escritura – Borrador original, SBP; Redacción: revisión y edición, TJL; Adquisición de Financiamiento, TJL

Correspondencia a Seung Bum Park o T. Jake Liang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Zhijuan Qiu y David Favero.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Park, SB, Khan, M., Chiliveri, SC et al. Las variantes omicron del SARS-CoV-2 albergan mutaciones en la proteína de espiga responsables de su fenotipo fusogénico atenuado. Commun Biol 6, 556 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04923-x

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Recibido: 07 Diciembre 2022

Aceptado: 08 mayo 2023

Publicado: 24 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04923-x

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