Regulación traslacional y proteína.

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 616 (2023) Citar este artículo

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TREM2 es un receptor transmembrana expresado en microglia y macrófagos. Los niveles elevados de TREM2 en estas células están asociados con condiciones patológicas relacionadas con la edad, incluida la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, el mecanismo regulador que subyace a la expresión proteica de TREM2 sigue sin estar claro. En este estudio, descubrimos el papel de la región 5 'no traducida (5'-UTR) de TREM2 humano en la traducción. Un codón de inicio aguas arriba (uAUG) en el 5′-UTR de TREM2 es específico de algunos primates, incluidos los humanos. La expresión de la proteína TREM2 convencional, a partir del AUG aguas abajo (dTREM2), es reprimida por la 5′-UTR de manera mediada por uAUG. También detectamos una isoforma de proteína TREM2 a partir de uAUG (uTREM2) que es degradada en gran medida por los proteasomas. Finalmente, la 5′-UTR es esencial para la regulación a la baja de la expresión de dTREM2 en respuesta a la inanición de aminoácidos. En conjunto, nuestro estudio identifica una función reguladora específica de especie de la 5′-UTR en la traducción de TREM2.

El receptor desencadenante expresado en las células mieloides 2 (TREM2) es una proteína transmembrana que actúa como un receptor de detección de lípidos1. TREM2 se expresa predominantemente en microglia en el cerebro. Además, participa en la fagocitosis microglial, la poda sináptica y la respuesta inflamatoria2,3,4. Se ha demostrado que variantes raras de TREM2 aumentan el riesgo de enfermedad de Alzheimer (EA)5,6. Además, las mutaciones homocigotas en TREM2 conducen a la enfermedad de Nasu-Hakola, una enfermedad rara caracterizada por demencia de aparición temprana y quistes óseos7. Las variantes de TREM2 asociadas a la enfermedad alteran las funciones específicas del sustrato y la supervivencia de la microglía8. Por el contrario, la expresión elevada de TREM2 o la activación de TREM2 mediada por anticuerpos rescata algunos fenotipos de enfermedad en ratones modelo AD9,10. TREM2 es esencial para la transición de la microglia homeostática a un estado microglial asociado a la enfermedad11. Su expresión también marca macrófagos asociados a tumores y macrófagos asociados a lípidos12,13. Por lo tanto, TREM2 ha sido implicado en condiciones relacionadas con la edad, incluyendo AD9,10,11, cáncer12 y obesidad13. Aunque se han demostrado las funciones celulares de TREM2, el mecanismo regulador de TREM2 sigue siendo esquivo.

El nivel de expresión adecuado de las proteínas está determinado por elementos no codificantes, como la región 5' no traducida (UTR)14. Upstream AUG (uAUG) es una característica conservada evolutivamente de la 5′-UTR entre humanos y roedores15. uAUG reprime la expresión de la proteína derivada del ORF principal aguas abajo (marco de lectura abierto) al interrumpir el escaneo de ribosomas o inducir la descomposición del ARNm mediada por tonterías16. Los estudios genéticos y bioinformáticos han estimado que ~60% de todos los genes humanos que codifican proteínas contienen uAUG17.

Aquí, informamos el papel de uAUG en el 5′-UTR de TREM2, ubicado aguas arriba del AUG aguas abajo (dAUG). Curiosamente, se determinó que uAUG se conservaba entre los primates, pero no en los ratones. Se descubrió que la 5′-UTR de TREM2 humana reprime la expresión de TREM2 convencional traducido de dAUG (denominado dTREM2) de una manera dependiente de uAUG. Además, detectamos una isoforma TREM2 derivada de uAUG. Nuestro estudio revela el papel dependiente de la especie del 5′-UTR en la traducción de TREM2.

Una comparación de secuencias reveló la presencia de un uAUG, ubicado 90 bases aguas arriba del dAUG en el 5′-UTR de TREM2 en la mayoría de las especies de primates, incluidos los humanos, pero no en otros mamíferos, como los ratones (Fig. 1a, Fig. 1). De aquí en adelante, nos referiremos a la región de base 90 aguas arriba de dAUG como 5′-UTR por simplicidad. Los conjuntos de datos de perfiles de ribosomas18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38 sugirieron que los ribosomas reconocen la mitad inicial de la 5′-UTR de TREM2 humano, pero no de la región correspondiente de Trem2 de ratón (Fig. 2a complementaria, Tabla 1 complementaria). Examinamos el uso relativo de uAUG en comparación con el de dAUG por parte de los ribosomas utilizando un conjunto de datos ribo-seq39 y descubrimos que el reconocimiento de uAUG por parte de los ribosomas fue ~ 30% del de dAUG (Fig. 2b complementaria). Aunque el tipo de célula era diferente, un análisis similar de microglia40 de ratón sugirió una fracción más baja (~ 5%) de Trem2 5′-UTR unido al ribosoma (Fig. 2b complementaria). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que uAUG influye en la traducción de dTREM2. Preparamos vectores de expresión en los que secuencias de 90 bases de longitud aguas arriba del dAUG de diferentes especies se fusionaron con la secuencia codificante (CDS) de TREM2 humano (Fig. 1b). El 5′-UTR de TREM2 humano disminuyó significativamente la expresión de dTREM2 en comparación con la construcción que carecía del 5′-UTR de TREM2 (Fig. 1c, d). Por el contrario, no se observó tal disminución en dTREM2 cuando el 5'-UTR de ratón se fusionó con este gen (Fig. 1c, d). Por su parte, la 5′-UTR de chimpancés y titíes mostró efectos intermedios. En particular, se detectó una banda de proteína más grande que la de dTREM2 cuando el 5'-UTR de los primates se fusionó con este gen (Fig. 1c, denominado uTREM2). Se prevé que la traducción de uAUG produzca una isoforma TREM2 con una extensión de 30 residuos de aminoácidos añadidos en el extremo N-terminal de dTREM2. Estos datos sugieren que uAUG desempeña dos funciones, la represión de la expresión de dTREM2 y la producción de uTREM2.

una comparación de secuencias de ARN de 90 bases corriente arriba de AUG corriente abajo (dAUG). Los uAUG y dAUG están resaltados en verde y gris, respectivamente. La sustitución de base está marcada en magenta. b Diagrama esquemático de construcciones quiméricas del CDS de TREM2 humano fusionado con la secuencia de 90 bases cadena arriba del dAUG de cada especie. c Resultados de la transferencia Western utilizando células HEK293 transfectadas con cada construcción quimérica. La flecha roja indica la banda de proteína de uTREM2. d Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína TREM2 en c. Se muestran los resultados de la prueba de Tukey. Las barras de error representan la media ± SD (n = 4).

Para dilucidar aún más el papel de uAUG, establecimos líneas celulares isogénicas utilizando el sistema Flp-In basado en HEK293, para expresar de manera estable un minigen TREM2 humano de longitud completa que contiene el 5′-UTR en el que se mutaron uAUG y/o dAUG ( Figura 2a). El análisis de transferencia Western de los lisados ​​​​celulares totales mostró una disminución en dTREM2 derivado de la línea celular 5'-UTR-WT en comparación con el de 5'-UTR-ninguno (Fig. 2b, c). Por el contrario, el nivel de expresión de dTREM2 derivado de 5′-UTR-Mu fue comparable al derivado de 5′-UTR-none (Fig. 2b, c). No se observaron bandas de proteína TREM2 en las líneas celulares 5′-UTR-Md y 5′-UTR-Mud (Fig. 2b). Por lo tanto, el nivel de expresión de la proteína dTREM2 se reguló de manera dependiente de uAUG, mientras que el ARNm de TREM2 derivado de 5′-UTR-WT, 5′-UTR-Md y 5′-UTR-Mud no mostró ninguna reducción en comparación al nivel de 5′-UTR-ninguno (Fig. 2d). Por lo tanto, uAUG es esencial para la represión de dTREM2 por parte de la 5′-UTR a nivel de traducción.

a Diagrama esquemático de una serie de construcciones del minigen fl-TREM2 con o sin la 5′-UTR (región no traducida). Los codones de iniciación mutados se indican en rojo. Las células HEK293 que expresan de manera estable estos minigenes se establecieron utilizando el sistema Flp-In. b Los lisados ​​celulares totales de cada línea celular estable se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sondaron con un anticuerpo anti-TREM2. c Cuantificación de los resultados del Western Blot. Los datos representan la media ± DE (n = 3, prueba de Tukey). d Los niveles de ARNm de TREM2 en cada línea celular se normalizaron a ACTB. Las barras de error indican la media ± SD (n = 3, prueba de Tukey). No se detectaron diferencias significativas entre las células 5′-UTR-none y 5′-UTR-WT.

Como se muestra en la Fig. 2b, uTREM2 apenas se pudo detectar en los lisados ​​​​celulares totales de las células 5'-UTR-WT y 5'-UTR-Md. Luego investigamos las condiciones óptimas para detectar la expresión de uTREM2. El uso de Triton-X-100 al 0,1 % para la lisis celular y un anticuerpo contra el extremo C-terminal de TREM2 para la inmunotransferencia facilitó la detección de la banda de proteína correspondiente a uTREM2 en las células 5′-UTR-WT (flecha roja, figura complementaria . 3). Además, uTREM2 se detectó claramente cuando se usó la fracción de proteína unida a la membrana (Fig. 3a). Las células THP-1 produjeron una banda de proteína de uTREM2 endógeno solo cuando estas células se trataron con forbol-miristato-acetato (PMA) (Fig. 3 complementaria). La banda de uTREM2 se detectó en la fracción de proteína unida a la membrana de 5′-UTR-WT, pero no en las otras células (Fig. 3a).

a Las fracciones de proteínas unidas a la membrana de líneas celulares estables se sometieron a análisis de transferencia Western. La flecha roja indica la banda de proteína de uTREM2. Se utilizó APP como control de carga. b Esquema de inmunoprecipitación y tratamiento con PNGasa F. c Inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-TREM2 en las células indicadas. Las flechas rojas indican uTREM2. d Las células 5'-UTR (región no traducida)-ninguna, 5'-UTR-WT, 5'-UTR-Mu y 5'-UTR-Md se sometieron a inmunoprecipitación seguida de desglicosilación con PNGase F. e TREM2 expresado en THP Las células -1 se inmunoprecipitaron seguidas de tratamiento con PNGasa F. Las flechas rojas y azules indican la banda de proteína de uTREM2 y uTREM2 desglicosilado, respectivamente (d, e).

Para examinar la integridad de uTREM2, se inmunoprecipitaron células 5′-UTR-none, 5′-UTR-WT y THP-1 con un anticuerpo contra el ectodominio de dTREM2 y se probaron con otro anticuerpo contra su extremo C (Fig. 3b ). Tanto las células 5′-UTR-WT como las THP-1 dieron como resultado una banda de proteína de uTREM2 en la fracción inmunoprecipitada (flechas rojas, Fig. 3c). Esto también indicó que uTREM2 comparte secuencias de ectodominio y C-terminal con dTREM2. Para confirmar si uTREM2 contiene péptidos N-terminales específicos, la banda de proteína de uTREM2 de las células 5'-UTR se sometió a análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) después de la inmunoprecipitación. En consecuencia, detectamos un péptido, MPDPLFSAVQGK, que correspondía al extremo N único de uTREM2 (Fig. 4 complementaria), lo que respalda nuestra hipótesis de que la traducción de uAUG conduce a la producción de proteína uTREM2.

TREM2 se somete a glicosilación como modificación postraduccional41. Para verificar que uTREM2 estaba glicosilado, los productos inmunoprecipitados derivados de nuestras líneas celulares estables se desglicosilaron con PNGasa F (Fig. 3b). En ausencia de PNGasa F, los inmunoprecipitados de las células 5′-UTR-WT y 5′-UTR-Md mostraron una banda de proteína de uTREM2 (flechas rojas, Fig. 3d). Por lo tanto, uTREM2 se expresó en las células 5′-UTR-Md, y la falta de detección en experimentos anteriores podría deberse al bajo nivel de uTREM2. Después del tratamiento con PNGase F, tanto 5′-UTR-none como 5′-UTR-Mu mostraron patrones similares (Fig. 3d). En particular, se detectó una banda de proteína única en las células 5′-UTR-WT y 5′-UTR-Md, que estaba ausente en las células 5′-UTR-none y 5′-UTR-Mu y debería derivar de la uAUG (Fig. 3d, indicado por flechas azules), lo que implica que uTREM2 está sujeto a glicosilación (Fig. 3d). Además, las células THP-1 mostraron un patrón de banda de proteína similar al de 5′-UTR-WT (Fig. 3e). Estos resultados sugirieron que uTREM2 está glicosilado.

Para verificar que uTREM2 se traduce de uAUG, preparamos una serie de minigenes mutantes fl-TREM2 con un codón de terminación en 5′-UTR (Fig. 4a). Como uAUG es el primer codón de uTREM2, la sustitución que comprende los codones 6 y 23 de uAUG se denominó F6X y C23X, respectivamente. La banda de proteína de uTREM2 se eliminó en los minigenes 5′-UTR-WT-F6X y 5′-UTR-WT-C23X (flechas rojas, Fig. 4b). Simultáneamente, el nivel de expresión de dTREM2 se restauró parcialmente con estas construcciones, lo que sugiere que se requiere una traducción continua de uAUG a dAUG para la regulación represiva de la traducción de TREM2. El nivel de proteína dTREM2 derivada de los minigenes 5′-UTR-Mu-F6X y 5′-UTR-WT-C23X fue comparable al del minigen 5′-UTR-Mu (Fig. 4b). Además, las bandas de proteínas de uTREM2 y dTREM2 se detectaron con el minigen 5′-UTR-Md; sin embargo, no se detectó ninguna banda de proteína con los minigenes 5′-UTR-Md-F6X y 5′-UTR-Md-C23X (Fig. 4b). Esto indica fuertemente que ambas bandas se derivaron de la traducción iniciada por uAUG del minigen 5'-UTR-Md.

a Las líneas azules representan los codones de terminación introducidos entre uAUG y AUG corriente abajo (dAUG). F6X y C23X representan codones de parada introducidos en la 5′-UTR (región no traducida) de TREM2. b Las fracciones unidas a la membrana de células HEK293 transfectadas con estos minigenes se analizaron mediante transferencia Western. Se utilizó APP como control de carga. Las flechas rojas indican uTREM2. c Diagrama esquemático de mutantes de cambio de marco. Se indujo un cambio de marco en minigenes mediante una inserción de un solo nucleótido en el medio de la 5'-UTR. d Las fracciones de membrana de las células HEK293 transfectadas con minigenes de cambio de marco se sometieron a análisis de transferencia Western usando un anticuerpo anti-TREM2.

También preparamos un minigen de longitud completa con un 5′-UTR en el que se introdujo un cambio de marco mediante una inserción de un solo nucleótido (Fig. 4c, denominado FS). La expresión de uTREM2 también se interrumpió con el minigen 5′-UTR-WT-FS (Fig. 4d). Sorprendentemente, el nivel de expresión de dTREM2 derivado de 5′-UTR-WT-FS fue comparable al de 5′-UTR-WT (Fig. 4d), lo que indica que la mutación de cambio de marco no aumentó la expresión de dTREM2. Esto contrastaba con la observación anterior (Fig. 4b) en la que dTREM2 de 5′-UTR-WT aumentó al introducir mutaciones puntuales (F6X o C23X). Estas observaciones están en línea con el hecho de que la traducción continua de uAUG que pasa por dAUG podría contribuir a la represión de dTREM2. Las bandas de proteína de uTREM2 y dTREM2 se anularon con el minigen 5'-UTR-Md-FS (Fig. 4d). Junto con la observación que se muestra en la Fig. 4b, estos resultados plantean la posibilidad de que uTREM2 se someta parcialmente a digestión en el péptido señal y produzca la proteína dTREM2. No hubo diferencia en la localización intracelular de TREM2 entre estos mutantes (Fig. 5 complementaria).

A continuación, investigamos la importancia de la 5′-UTR de TREM2 en la fisiología celular al comparar la respuesta de la expresión de TREM2 al estrés celular (Fig. 5a, Fig. 6a complementaria). Las condiciones de estrés celular probadas en este estudio fueron las siguientes: (i) privación de aminoácidos; (ii) bafilomicina A1 (BafA1), un inhibidor vacuolar de H+-ATPasa; (iii) un inhibidor del proteasoma, MG132; (iv) ácido poliinosínico-policitidílico (poliI:C), un análogo sintético del ARN de doble cadena (dsRNA); y (v) lipopolisacárido (LPS), un mediador de la inflamación. El nivel de expresión de dTREM2 derivado de las células 5'-UTR-none no se alteró en las condiciones examinadas (Fig. 5b). Curiosamente, apareció una banda ligeramente más pequeña que dTREM2 específicamente en las células 5′-UTR-WT con tratamiento MG132 (Fig. 5a), lo que sugiere la presencia de una proteína TREM2 derivada de 5′-UTR que fue degradada completamente por el proteasoma. Además, el nivel de expresión de dTREM2 en células 5′-UTR-WT se redujo significativamente por la privación de aminoácidos y el tratamiento con poliI: C (Fig. 5a, c). El tratamiento con BafA1 y LPS no alteró los niveles de expresión de TREM2 (Fig. 5a, c). Sin embargo, el tratamiento simultáneo con la inanición de aminoácidos y BafA1 redujo el nivel de expresión de dTREM2 en el 5'-UTR-WT (Fig. 5d), lo que demuestra que la reducción en dTREM2 mediada por la inanición de aminoácidos no se debió a una mayor degradación a través de la autofagia. El nivel de expresión de dTREM2 en células 5′-UTR-Mu no se vio alterado por la inanición de aminoácidos, mientras que en las células 5′-UTR-Md disminuyó (Fig. 5e), lo que indica que uAUG es esencial para la regulación a la baja de uTREM2 y dTREM2 mediada por la inanición de aminoácidos. La proteína dTREM2 endógena en las células THP-1 exhibió una regulación a la baja similar tras la inanición de aminoácidos (Fig. 6b complementaria). Finalmente, analizamos la localización intracelular de TREM2 por inmunofluorescencia. Si bien se obtuvo la señal TREM2 de las líneas celulares 5′-UTR-none y 5′-UTR-Mu, la de las células 5′-UTR-WT y 5′-UTR-Md fue casi indetectable (Fig. 7 complementaria) . Por lo tanto, expresamos transitoriamente los minigenes TREM2 y observamos la localización de TREM2. Aunque la expresión de TREM2 aún era baja en las células transfectadas con 5′-UTR-Md, el patrón de localización fue similar entre las cuatro construcciones, con pequeños cambios inducidos por diferentes tratamientos (Fig. 8 complementaria).

a Las líneas celulares 5′-UTR-none y WT se expusieron a estrés celular. Las fracciones de proteínas unidas a la membrana se sometieron a transferencia Western utilizando los anticuerpos indicados. La flecha roja indica uTREM2 (isoforma de la proteína TREM2 a partir de AUG aguas arriba). b, c Cuantificación de TREM2 aguas abajo (dTREM2) de células 5′-UTR-none (b) y células 5′-UTR-WT (c) en función de los resultados de Western blot. Las diferencias con el control no tratado se analizaron usando la prueba de Dunnett. Las barras de error representan la media ± SD (n = 4). d, e Las líneas celulares estables se cultivaron en un medio de inanición con bafilomicina A1. Se usaron lisados ​​de células totales para confirmar los efectos del tratamiento.

Como se muestra en la Fig. 5a, el tratamiento con MG132 dio como resultado una banda ligeramente más pequeña que dTREM2 en las células 5′-UTR-WT, pero no en las células 5′-UTR-none. Esta banda también se detectó en células 5′-UTR-Md tras el tratamiento con MG132 (Fig. 6a), lo que sugiere fuertemente que se derivó de uAUG. Se detectó una banda similar en la fracción de membrana de las células THP-1 tratadas con MG132, aunque a un nivel más bajo (Fig. 6b). Por lo tanto, parece que la mayoría de los productos derivados de uAUG son degradados por proteasomas.

a Los lisados ​​​​celulares totales de líneas celulares estables se trataron con MG132 y se analizaron mediante transferencia Western. Se usó ubiquitina (Ub) como control positivo para el tratamiento con MG132. Las flechas rojas y azules indican la banda de proteína de uTREM2 intacto y una forma de uTREM2 sensible al proteasoma, respectivamente. b Análisis de transferencia Western de la fracción de proteína unida a la membrana de las células tratadas con MG132. c Hipótesis de trabajo del procesamiento de uTREM2 (isoforma de proteína TREM2 a partir de uAUG). El proteasoma degrada una gran fracción de uTREM2 derivado de uAUG. La fracción restante de uTREM2 se glucosila y se escinde para producir dTREM2 (isoforma de proteína TREM2 que comienza aguas abajo de AUG).

En este estudio, revelamos un efecto regulador represivo en la traducción humana de TREM2 mediada por su 5′-UTR. También mostramos la participación de la 5′-UTR en la respuesta a la inanición de aminoácidos. Como estas características dependen de uAUG, que comparten algunos primates, nuestros resultados destacan las características específicas de la especie de TREM2. Descubrimos que la regulación mediada por uAUG de la traducción de TREM2 se conserva en algunos primates, pero no en ratones (Fig. 1). Aunque se espera que las proteínas TREM2 humanas y de ratón tengan funciones conservadas, es probable que estas dos proteínas estén sujetas a mecanismos reguladores divergentes. Por ejemplo, recientemente informamos que TREM2 se somete al empalme alternativo del exón 342. Un transcriptoma de un solo núcleo reveló respuestas conservadas y no conservadas entre la microglía humana y de ratón en el contexto de AD43. Por lo tanto, nuestros hallazgos podrían contribuir a la comprensión de los aspectos específicos de la especie de microglia. Recientemente, se ha informado sobre la regulación al alza de la traducción de Trem2 en un modelo de ratón de AD44. Debido a que uAUG de TREM2 que reprime la traducción de dTREM2 está ausente en Trem2 de ratón, la activación de la traducción de Trem2 en los ratones modelo AD puede ocurrir a través de un mecanismo distinto al que hemos descrito. Se necesita más investigación para determinar la importancia de estos hallazgos en pacientes con EA. Nuestros análisis de mutación también sugirieron que la traducción continua de uAUG a dAUG está involucrada en la represión de la expresión de dTREM2 (Fig. 4), lo que puede interpretarse como una competencia entre uAUG y dAUG por el inicio de la traducción. También encontramos que los niveles de dTREM2 se reducen por la inanición de aminoácidos y el tratamiento con poli(I:C), según el uAUG (Fig. 5), lo que sugiere la participación de determinantes adicionales45. El uso de dAUG podría estar limitado por varios factores en presencia de uAUG, incluidas las alteraciones en el rastreo ribosómico mediado por el inicio de la traducción en uAUG, la estructura secundaria de la 5′-UTR y los factores que actúan en trans que se unen a la 5′ -UTR46. Esclarecer el mecanismo preciso de la represión mediada por 5′-UTR proporcionaría una estrategia para modular la expresión de TREM2.

Además de la represión traduccional, el TREM2 5′-UTR también está involucrado en la expresión de uTREM2. La extensión de 30 residuos en el extremo N de uTREM2 aumenta la longitud del péptido señal. Inesperadamente, observamos una banda de proteína de dTREM2 junto con la de uTREM2 en células 5′-UTR-Md (Fig. 4b). Ambas bandas desaparecieron cuando se introdujo un codón de parada aguas abajo del uAUG (Fig. 4b). Proponemos que la región N-terminal de uTREM2 se escinda en el mismo sitio que el péptido señal de dTREM2, lo que resulta en la producción de dTREM2. La extensión N-terminal de uTREM2 alarga el péptido señal de 18 a 48 aminoácidos. Aunque la longitud promedio de los péptidos señal en eucariotas es de 22 residuos47, varios genes tienen un péptido señal largo de 40 o más residuos48. Sorprendentemente, detectamos una banda de proteína que recuerda a uTREM2 desglicosilado, específicamente en las células 5'-UTR-WT y 5-UTR-Md tras la inhibición del proteasoma (Fig. 6a, Fig. 9 complementaria). Especulamos que una fracción importante de uTREM2 se degrada rápidamente por los proteosomas y que la fracción restante se glucosila y se escinde para producir dTREM2 (Fig. 6c). Existe otro ejemplo de una proteína de membrana glicosilada (US11) que conserva su péptido señal debido a su escisión retardada49. El péptido de señal largo en uTREM2 podría haber dado como resultado la degradación proteasómica preferencial de uTREM2 y la escisión retrasada del péptido de señal. Aunque uTREM2 podría considerarse como un intermediario de una vía alternativa de producción de dTREM2, o como un subproducto de la represión de dTREM2 mediada por uAUG, se necesitan más estudios para determinar su funcionalidad.

En conclusión, este estudio reveló el papel de la 5′-UTR en la traducción del TREM2 humano. Como el mecanismo regulador de TREM2 mediado por uAUG no se conserva en ratones, nuestro estudio enfatiza la importancia de los estudios que utilizan células derivadas de humanos para obtener nuevos conocimientos sobre los trastornos relacionados con TREM2. La regulación de TREM2 a nivel de traducción también es importante, lo que podría pasarse por alto en los análisis de transcriptomas.

Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 2. Todos los plásmidos diseñados se sometieron a secuenciación de ADN.

La 5'-UTR de chimpancés, titíes y ratones se amplificó a partir del ADN genómico (obtenido de HSP-239, HSCj-11050 y 91062702, respectivamente) utilizando cebadores específicos. Los fragmentos de 5′-UTR y TREM2 CDS42 humano se combinaron mediante PCR, se digirieron con BamHI y XbaI y se clonaron en el sitio BamHI-XbaI de pcDNA3.1 Hygro (+) (Invitrogen).

Una serie de secuencias 5'-UTR de TREM2 humano con uAUG y/o dAUG mutados se fusionaron en el minigen fl-TREM2, como se describió anteriormente51. Para obtener la 5′-UTR con o sin una mutación en uAUG y/o dAUG, se usaron los minigenes TREM2 CDS y fl-TREM2 fusionados con 5′-UTR como moldes de PCR para amplificar la región desde la 5′-UTR a la medio del intrón 1. A continuación, se realizó la sustitución de ATG por GTG utilizando cebadores de PCR. Estos dos fragmentos se combinaron mediante amplificación mediada por PCR, se digirieron con NheI y HindIII y se clonaron en el sitio NheI-HindIII del minigen fl-TREM2.

Las sustituciones F6X y C23X (los números de residuos se contaron a partir del uAUG) y una inserción de cambio de marco de un solo nucleótido se introdujeron mediante PCR usando cebadores que albergaban la mutación correspondiente. Cada fragmento se digirió con NheI y HindIII y luego se clonó en el sitio NheI-HindIII del minigen fl-TREM2 que contenía la 5'-UTR de TREM2. La PCR para la construcción de plásmidos se realizó utilizando KOD plus neo (TOYOBO).

Las células HEK293 y HeLa se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Thermo Fisher Scientific), suplementado con suero fetal bovino al 10 % (Sigma) y penicilina/estreptomicina (Wako) a 37 °C con 5 % de CO2. La línea celular HSCj-110, derivada de Callithrix jacchus (JCRB1655), la línea THP-1 derivada de humanos y la línea celular HSP-239 derivada de Pan troglodytes (JCRB1165), se obtuvieron de JCRB50 y se mantuvieron en medio RPMI 1640 ( suplemento GlutaMAX, Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero fetal bovino al 10 % y penicilina/estreptomicina a 37 °C con 5 % de CO2. Previamente se estableció una línea celular estable que expresa el minigen fl-TREM2 sin el 5′-UTR (5′-UTR-ninguno)51. Las líneas celulares que expresan de manera estable los minigenes fl-TREM2 (5′-UTR-WT, Mu, Md y Mud) se establecieron utilizando el sistema Flp-In como se describe en nuestro estudio anterior51. La integración de los minigenes fl-TREM2 se confirmó mediante PCR, utilizando cebadores específicos de fragmentos.

Las células se trataron en las siguientes condiciones: DMEM (alta glucosa) con piruvato de sodio, sin aminoácidos (Wako) durante 4 h, bafilomicina 100 nM (Merck) durante 4 h, 10 μM MG132 (Sigma) durante 12 h, 2 μg mL −1 Poly(I:C) (Tocris Bioscience) durante 24 h con Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) y 1 μg mL−1 LPS (Sigma) durante 6 h. Las células HEK293 se sembraron en placas de 12 pocillos antes del día de la transfección del ADN plasmídico. Normalmente, se transfectaron 0,5 μg de plásmido en células HEK293 utilizando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) y se recogieron 48 h después de la transfección del plásmido. Se usó Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) para la transfección de los plásmidos en células HeLa.

La purificación del ARN total y el análisis cuantitativo se realizaron como se describió previamente52. Se utilizó ACTB como gen de referencia.

El fraccionamiento celular y el western blotting se realizaron como en estudios previos42. Las imágenes de transferencia se capturaron utilizando un Luminograph III (ATTO). Las intensidades de la señal se analizaron utilizando el software Fiji (NIH). Como se muestra en la Fig. 5, la membrana se tiñó con solución Ponceau S para medir la proteína total antes del bloqueo y el tratamiento con anticuerpos. Los anticuerpos utilizados para la transferencia Western se enumeran en la Tabla complementaria 3. Las imágenes de transferencia completa se muestran en la Fig. 10 complementaria.

La identificación de proteínas se realizó como se describió previamente53 con cambios menores. Brevemente, las muestras de inmunoprecipitación se separaron mediante SDS-PAGE y los geles se tiñeron con el Silver Stain MS Kit (Wako). Las bandas de proteína se escindieron del gel y se desteñeron con una solución de decoloración. Posteriormente, el gel se redujo con ditiotreitol 25 mM y se alquiló con yodoacetamida al 1% (p/v) en bicarbonato de amonio 25 mM. Cada gel se tripsinizó durante la noche a 37 °C en tampón de digestión [bicarbonato de amonio 50 mM, tensioactivo ProteaseMax al 0,01 % (p/v) (Promega), 1,33 μg ml−1 de tripsina (Promega) y 1,33 μg ml−1 de lisil endopeptidasa ( Wako)], y se retuvo el sobrenadante. Los péptidos se extrajeron de las porciones de gel cortadas con ácido trifluoroacético al 2,5 % después de agitar durante 15 min. Después de la digestión, los péptidos resultantes se desalinizaron y concentraron utilizando StageTips (Thermo Fisher). El programa de gradiente con las fases móviles A y B (acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico) tuvo la siguiente secuencia: 0 % B (0 min)–30 % B (50 min)–100 % B (51 min)–100 % B ( 60 minutos). Los datos de LC-MS/MS se procesaron con Proteome Discoverer versión 2.4 (Thermo Fisher Scientific). Agregamos la secuencia de aminoácidos de uTREM2 a la base de datos Uniprot (versión 04/2017, con 20.198 secuencias).

La inmunofluorescencia se realizó de acuerdo con los métodos descritos en nuestro estudio anterior42. Brevemente, las células HeLa y las líneas celulares estables HEK Flp-In se cultivaron en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos (WATSON). Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % (Wako) durante 10 min y se trataron con Triton al 0,1 % durante 5 min. Después de 3 h de incubación con anticuerpo anti-TREM2 C-term, las células se trataron con Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo Ig (H + L) o Alexa Fluor 568 burro anti-conejo IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific ) durante 1 h. Las células se montaron con medio de montaje Vectashield con DAPI (VECTOR LABORATORIES). Las imágenes de las células se obtuvieron mediante microscopía confocal (LSM710; Carl Zeiss).

Para la inmunoprecipitación, se mezcló un anticuerpo anti-TREM2 humano de cabra (R&D, AF1828) con perlas magnéticas conjugadas con proteína G (Thermo Fisher Scientific). Las células se lisaron en Triton-X al 0,1 % en PBS con inhibidor de proteasa 1x (Roche), seguido de rotación a 4 °C durante 30 min. Después de la centrifugación (16 000 × g a 4 °C durante 10 min), el sobrenadante se aclaró previamente con perlas magnéticas conjugadas con proteína G a 4 °C durante 2 h y se inmunoprecipitó con perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo anti-TREM2 o un control de isotipo. haciéndolo girar durante la noche a 4 °C. Las perlas se lavaron tres veces con Triton-X al 0,1 % en PBS. Los inmunoprecipitados se eluyeron de las perlas en tampón Gly-HCl 0,1 M (pH 2,5, que contenía NaCl 0,15 mM). Se usó un anticuerpo anti-TREM2 de conejo (CST, D8I4C) como anticuerpo principal para la transferencia Western. Se utilizó TrueBlot anti-IgG HRP (ROCKLAND) como anticuerpo secundario.

Los productos inmunoprecipitados con anticuerpos anti-TREM2 se sometieron a desglicosilación utilizando PNGasa F (NEB) según las instrucciones del fabricante.

Se utilizó el software EXCEL Toukei (ESUMI Co., Ltd.) para el análisis estadístico. Todos los gráficos se produjeron utilizando el software R (versión 3.6.1, https://www.r-project.org/). Los tamaños de muestra se definen en las leyendas de las figuras. Se tomaron medidas de distintas réplicas biológicas que representan transfecciones o tratamientos celulares independientes. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales y se describen en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen están disponibles en Datos complementarios 1. Los blots completos se muestran en la Información complementaria. Todos los demás datos están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud.

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Agradecemos al Dr. Jun-ichi Satoh por la supervisión y los útiles comentarios ya la Sra. Minako Sato, la Sra. Hazuki Goshima y la Sra. Yuka Oda por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por Subvenciones para la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) a YK (16K09683, 19K07982, 16K07043, 20K07876) y MY (19J15024, 21K20700), y por el Proyecto del Centro de Desarrollo de Recursos de Medicamentos para la Demencia (DRC), MEXT, Japón (S1511016). MY recibió el apoyo de una subvención para becarios de JSPS (número de subvención JP19J15024) y una beca de investigación en memoria de Nagai de la Sociedad Farmacéutica de Japón.

Departamento de Bioinformática y Neuropatología Molecular, Universidad Farmacéutica Meiji, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokio, 204-8588, Japón

Motoaki Yanaizu, Haruka Adachi y Yoshihiro Kino

Departamento de Terapéutica y Patobiología del ARN, Universidad Farmacéutica Meiji, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokio, 204-8588, Japón

Motoaki Yanaizu y Yoshihiro Kino

Departamento de Bioquímica, Universidad Farmacéutica Meiji, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokio, 204-8588, Japón

Makoto Araki y Kenji Kontani

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MY YK concebido y diseñado los experimentos y escribió el manuscrito. MI y HA realizaron experimentos. MA y KK realizaron procedimientos de espectrometría de masas. Todos los autores han aprobado el manuscrito.

Correspondencia a Yoshihiro Kino.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Dileep Kumar y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Gracjan Michlewski y Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Yanaizu, M., Adachi, H., Araki, M. et al. Regulación traduccional y capacidad de codificación de proteínas de la región 5 'no traducida de TREM2 humano. Comun Biol 6, 616 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04998-6

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Recibido: 08 Septiembre 2022

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 08 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04998-6

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